線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 25 管/24 樣
測(cè)定意義
線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過(guò)程水解ATP。此外，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。
測(cè)定原理
復(fù)合體Ⅴ水解 ATP 產(chǎn)生 ADP 和 Pi，通過(guò)測(cè)定 Pi 增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。
需自備的儀器和用品
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：25mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：1 mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前每支加入 1.3mL 蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;試劑五：6mL×1 瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 3mL 蒸餾水，充分混勻;試劑七：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10mL 蒸餾水，充分混勻;試劑八：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10mL 蒸餾水，充分混勻;試劑九：液體 10mL×1 瓶，室溫保存。
定磷試劑的配制：按 H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請(qǐng)根據(jù)需要，用多少配多少）。
注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1 準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2 將勻漿 600g，4℃離心 5min。
3 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心 10min。
4 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ（此步可選做）。
5 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 800uL 試劑二和 8uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測(cè)定。
測(cè)定步驟
1、酶促反應(yīng)
| 試劑名稱（μL） | | | 對(duì)照管 | | | 測(cè)定管 | |
| | | | | | | | |
| 試劑四 | | | 50 | | | 50 | |
| | | | | | | | |
| 試劑五 | | | 200 | | | 200 | |
| | | | | | | | |
| 樣本 | | | | | | 250 | |
| | | | | | |
| 混勻， 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴 30min | |
| | | | | | | |
| 試劑六 | | | 100 | | | 100 | |
| | | | | | | | |
| 樣本 | | | 250 | | | | |
| | | | | | | | |
| | 混勻，4000g，室溫離心 10min，取上清液 | | |
| 2、定磷 | | | | | | | |
| 上清液 | | 250 | | | 250 | |
| 定磷試劑 | | 1250 | | | 1250 | |
混勻，室溫靜置 10min 左右，在 660nm 處讀取 A 測(cè)定管和 A 對(duì)照管，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A對(duì)照管。
復(fù)合體Ⅴ活性計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 1.2487x + 0.0361；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y 為 A 值。1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算:
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。復(fù)合體Ⅴ活性（U/mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T =64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（U/g 鮮重）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。復(fù)合體Ⅴ活性（U/104 cell）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T
=0.103× (ΔA-0.0361)
V 反總：反應(yīng)體系總體積，6×10-4 L； V 樣：加入樣本體積，0.25 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.808 mL；T：反應(yīng)時(shí)
間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。
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